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迪赢生物推出高通量DNA独立合成技术平台,填补全球技术空白

2023. 03. 31

DNA合成的重要性和发展

 

寡核苷酸合成是诊断和治疗应用的一个重要工具。新兴的应用之一是新的基因组合成,它是通过组装大量合成的配体核苷酸实现的。据报道,合成DNA序列的能力大约每3年就会翻一番,这使得重新设计细菌基因组成为可能。

 

这些应用的障碍之一是合成新的基因组的成本。随着大规模并行合成技术的发展,寡核苷酸合成的成本已经急剧下降。相比之下,昂贵而费力的测序验证和纠错步骤仍然是不可避免的。这些步骤成本较高,占据了总成本的很大一部分。为了减少测序验证和纠错步骤,提高合成的寡核苷酸的质量是至关重要的。

 

 

迪赢为什么要研发高通量DNA独立合成技术

 

目前寡核苷酸的化学合成是由Marvin H. Caruthers小组在1981年开发的亚磷酰胺化学方法实现的。根据合成载体、碱基添加方式的不同,主要分为柱式合成法和芯片合成法。

 

 

柱式寡核苷酸化学合成应用场景及不足

 

柱式寡核苷酸化学合成是目前多款商用自动化合成仪采用的主要方法。柱式寡核苷酸化学合成利用一个带有反应腔的合成柱,装载用于寡核苷酸合成的固相载体,目前常用的固相载体为可控微孔玻璃(controlled pore glass,CPG),配合流体系统,来实现化学寡核苷酸合成的四步循环反应。

 

由于使用的是单个合成柱,寡核苷酸可单条单独合成及回收,单条产量可达到nmol,甚至mmol。适用于合成种类要求较少,单条寡核苷酸用量较大的应用场景,如PCR引物,qPCR探针,寡核苷酸药物等大规模原料的制备。

 

不足之处在于合成通量较低,且因为合成过程中消耗试剂多而导致的合成成本高。

 

 

芯片法寡核苷酸化学合成应用场景及不足

 

不同于柱式合成,芯片合成中寡核苷酸的化学合成反应是在修饰芯片载体上完成的。

 

 

芯片合成的最大优势在于一次可以并行合成上万乃至上百万条寡核苷酸,与柱式合成相比通量大幅提升,单条成本大幅降低。不同于柱式合成所合成出来的寡核苷酸是每条单独存在的,高通量芯片合成的寡核苷酸通常以混合库的形式存在;同时,合成的混合库中单条寡核苷酸的量也远远低于柱式合成,为fmol级。

 

该方法适用于突变体库构建、探针捕获文库、CRISPR文库构建等对合成量要求不高但序列种类复杂的领域。

 

 

迪赢簇式喷墨法高通量DNA独立合成技术填补全球技术空白

 

然而,对于既需要高通量,又需要独立回收且要求单条高产量的需求,如基因合成,DNA杂交捕获探针,传统柱式合成和芯片合成都不能很好地满足需求。迪赢开发的簇式喷墨法高通量DNA独立合成技术填补了该领域的全球技术空白。

 

该技术基于簇式喷墨法的高通量合成平台,能提供高性价比的寡核苷酸单条独立式合成。单条产量控制在pmol级,同时扩展了并行合成通量,目前支持6K规格,后续支持拓展到12K、24K等规格。

 

该技术特别适用于基因合成和DNA杂交捕获探针合成。

 

 

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图1.簇式喷墨法DNA独立合成技术原理示意图

 

 

应用场景

 

簇式喷墨法高通量DNA独立合成用于基因合成

 

使用柱式合成法进行基因合成时,每条序列独立合成完成后需要混合成寡核苷酸池再进行后续的基因组装,需要复杂的手工混合寡核苷酸池过程,并且每条序列合成的产量一般为nmol量级,远大于组装时的需求量,造成原料浪费进而提高合成成本。

 

而基于芯片的高通量合成,虽然合成单条序列成本低,但单个寡核苷酸合成的产量一般为fmol量级,后续基因组装前需要先进行多次PCR扩增。当一张芯片上合成的全部核酸序列需要切割下来成为一种混合物时,为了避免混合物中多种序列间的相互作用,每种核酸的序列和合成的量需要精心设计,而且在基因合成时,需要将寡核苷酸混合物用通用引物等方法将混合物拆分出若干个寡核苷酸亚池,再进行后续的基因组装,过程操作复杂。

 

簇式喷墨法高通量DNA合成产量适中,能够达到无需进行PCR扩增同时不造成浪费,非常适用于基因合成。结合迪赢自主研发的自动化基因合成装置,可实现简单低成本、高通量自动化的基因合成。

 

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图2.高通量基因合成流程图

 

簇式喷墨法高通量DNA独立合成用于DNA杂交捕获探针合成

 

DNA杂交捕获探针根据覆盖区域大小不同,需要几千到几十万不等的寡核苷酸探针,同时要求每条探针量达到pmol级。

 

传统柱式合成方法合成产量过高,且通量受限,目前最大通量可实现768条寡核苷酸并行合成。提升合成通量的解决方案通常是直接增加设备和劳动力数量,但从长远来看,这种解决方案不利于节能减排和降低成本。

 

使用芯片合成可以满足通量需求,但单条寡核苷酸探针产量过低。

 

相比之下使用迪赢簇式喷墨法高通量DNA独立合成平台能够很好满足通量和产量的需求,实现最高性价比。

 

 

平台合成数据展示

 

以下为簇式喷墨法高通量合成平台合成寡核苷酸独立回收后进行凝胶电泳及质谱检测的部分结果展示。

 

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图3.凝胶电泳图(数字代表随机抽取的编号)

7图4.质谱图

 

 

迪赢持续研发新一代核酸合成

 

迪赢生物专注新一代核酸合成,除簇式喷墨法高通量DNA独立合成技术,同时还拥有超高通量芯片法寡核苷酸合成技术。未来迪赢也将持续研发,期望通过技术突破实现更高质量、更长长度以及更低成本的核酸合成,助力相关领域的发展。

 

 

【参考文献】

1. Yoshiaki Masaki., Yukiko Onishi., Kohji Seio. Quantification of synthetic errors during chemical synthesis of DNA and its suppression by non-canonical nucleosides. Sci Rep, 2022 Jul 15;12(1):12095

2,Hoose, A., Vellacott, R., Storch, M. et al. DNA synthesis technologies to close the gene writing gap. Nat Rev Chem (2023).

3,Kosuri, S., Church, G. Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications. Nat Methods 11, 499–507 (2014).

4, 黄小罗, 戴俊彪. 人工DNA合成技术DNA数据存储的基石.合成生物学. 2021.2(3):335-353

 

 

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