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引物的合成原理和自动化合成

2025. 01. 15

引物是分子生物学实验的核心工具之一,广泛应用于PCR扩增、基因测序、qPCR和基因编辑等技术中。引物合成是通过化学方法合成一段短链的寡核苷酸序列。

 

引物合成的基本原理

引物合成基于磷酸三酯化学法(Phosphoramidite Chemistry),这是当前主流的寡核苷酸合成技术,主要包括以下几个步骤:

1. 单核苷酸的制备

单核苷酸(A、T、C、G)的合成是引物合成的基础。这些单体核苷酸需要经过化学修饰以确保在反应过程中具备反应活性,同时防止不必要的副反应。例如:

- 保护基团的应用:碱基部分(如腺嘌呤的氨基)需要加入保护基团(如Bz、DMTr),以防止非特异性反应。

- 活化基团的引入:磷酸三酯化学中的活化基团(如磷酰胺)用于引发单核苷酸间的化学键形成。

2. 合成步骤

引物合成按照从3'到5'方向逐步延伸的方式进行,主要包括以下步骤:

- 脱保护:首先去除5'-端的保护基团,使其暴露为活性羟基。

- 偶联反应:将下一个单体核苷酸通过磷酸酰胺键与前一个核苷酸连接。

- 氧化:偶联后通过氧化反应稳定磷酸酯键。

- 阻断未反应位点:未参与偶联的羟基需要进行封闭处理,避免生成副产物。

- 重复循环:每个循环添加一个核苷酸,重复上述步骤,直到合成完成。

3. 脱保护与纯化

完成序列合成后,需要去除所有化学保护基团并将寡核苷酸从固相载体上释放,同时进行纯化(如HPLC或PAGE),以去除未完全合成的短链核苷酸。

 

引物合成

 

引物合成技术的发展

引物合成技术经历了多次革新,从最早的酶促合成到现代的自动化化学合成,效率和精确度不断提高。

- 早期手动化学合成:最初的化学合成依赖于手工操作,效率低下且易受污染影响。

- 自动化合成仪的引入:20世纪80年代,磷酸三酯自动合成仪的出现使得引物合成的速度和产量得到了显著提升。

- 高通量合成技术:近年来,高通量寡核苷酸合成平台的问世使得大规模引物池的生产成为可能,满足了合成生物学和基因组学的需求。可点击迪赢引物池(Primer Pool)/寡核苷酸池(Oligo Pool)了解更多详情。

 

自动化合成

自动化合成仪是一种高度精密的仪器,用于通过磷酸三酯化学法高效地合成寡核苷酸。其设计和运行原理主要包括以下几个核心部分:

1. 固相载体的使用

- 固相合成法是自动化引物合成仪的核心技术。固相载体通常是微小的玻璃或聚苯乙烯珠,上面附着着引物合成的起始核苷酸。

- 通过固相合成,可以简化清洗步骤并提高合成效率。

2. 核苷酸的逐步添加

- 每次循环中,单个核苷酸通过磷酰胺化学键与前一个核苷酸结合。

- 每个反应周期包括去保护、偶联、氧化和封端四个步骤,自动化仪器通过精确控制试剂的加入和反应时间确保合成的准确性。

3. 精确的试剂分配系统

- 合成仪内置精密的液体处理系统,能够准确分配微量试剂(如保护基团、活化剂和洗脱液)。

- 确保每个反应步骤都能在最佳条件下进行,避免非特异性反应。

4. 温控和时间控制

- 合成仪配备精准的温控系统,确保化学反应在最佳温度下进行。

- 各个步骤的反应时间由程序预设,确保核苷酸能够高效结合。

5. 软件与自动化流程

- 合成仪的软件系统允许用户根据实验需求设定序列和合成参数。

- 现代仪器通常支持远程监控和数据记录,便于追踪和分析每批引物的合成情况。

 

相较于早期的手动化学合成,自动化合成具有显著的技术优势:

高效率和高通量

自动化合成仪可以在短时间内完成大量引物的合成,例如高通量寡核苷酸池(oligo pool)的生产,为基因组学和合成生物学提供了关键支持。

精准性

由于全程自动化操作,合成过程中的人为误差被降到最低。现代仪器能实现单核苷酸级别的精确控制,确保序列的准确性。

可定制性

- 支持多种特殊修饰(如荧光标记、磷酸化、巯基修饰)。

- 满足用户对特定序列和功能的定制需求。

环保性

- 自动化设备能优化试剂使用量,减少浪费和环境污染。

 

迪赢的引物合成服务

迪赢生物作为引物合成领域的先行者,采用先进的自动化合成仪器和高通量合成平台,能够高效生产多样化的高质量引物。迪赢引物合成服务具有以下特点:

- 灵活定制:支持多种修饰方式(如荧光标记和生物素修饰)。

- 高纯度:提供脱盐、PAGE和HPLC等多种纯化方式。

- 快速交付:优化的生产流程确保产品快速交付。

- 批量生产:适合高通量需求的科研项目。

 

>> 了解更多:迪赢定制引物详情&数据

 

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地址:上海市闵行区光华路248号5号楼2楼

邮箱:zhengyuqing@dynegene.com

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