实验干货｜突变体文库构建详细流程，看完这个小白也能会！

寡核苷酸池（oligo pools）由于高通量、高性价比、精准可控、灵活组装的核心优势，早已成为当下突变体文库构建的主流选择。以寡核苷酸池（oligo pools）为原料进行文库构建，既能精准合成任意密码子的DNA片段，还能剔除不需要的密码子，大大减少文库的大小，使从文库中筛选候选者更高效、更便捷。

 

但很多人对“如何用寡核苷酸池构建突变体文库”一知半解，构建文库总卡壳，想入门摸不着头绪！别慌！今天，我们就一次性讲透，手把手教你走通全流程，小白看完也能直接上手实操！

 

突变体文库构建有哪些重要步骤？

实验前准备

• 寡核苷酸池储存要点

寡核苷酸池冻干或重悬状态下，-20℃储存可保存至少 24 个月，-80℃适合长期保存。建议储存前完成重悬，重悬后分装保存，避免反复冻融影响活性。

• 重悬寡核苷酸文库池

a）在18°C-25°C下，离心2分钟；

b）加入200μL TE缓冲液 (pH 8)，并以中速涡旋30秒；

c）置于65°C条件下孵育10分钟；

d）分装成小份，置于-20°C条件冷冻保存

注：对于大小约为 0.4–0.8pmol 的文库（例如，长度为200nt、质量为212ng 的文库），建议使用200μL TE 缓冲液。对于大小差异显著的文库，应相应调整TE用量，建议每 0.1pmol 文库使用 25–50μL TE。

 

核心实验步骤

1.PCR扩增

寡核苷酸池PCR扩增环节中，扩增体系和条件是保证产物质量的关键，核心原则为高模板量、少循环数，同时搭配高质量试剂与合理体系设置。

1）推荐扩增体系

• PCR反应混合液组分

• PCR程序

• PCR引物的退火温度由引物的长度和序列决定，建议根据引物进行相应调整

 

2）PCR产物做2％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收大小正确的目的片段，用胶回收试剂盒纯化后，溶于ddH2O备用。

扩增环节注意事项

• 反应体系：PCR 最终反应体积控制在50µL以内，如需提高产量，可增加反应管数，而非单管扩大体积；

• 产物纯化：PCR 后建议对扩增产物纯化再进行下游实验，对于＞100bp 的扩增产物，可采用硅胶柱、SPRI 磁珠或同类方法纯化。

 

2. 限制性酶切

文库和质粒的限制性酶切是高质量建库的关键步骤，建议采用两种不同的限制性内切酶进行酶切，若使用同一种酶，可能会导致部分序列错误整合。

1）文库片段酶切

• 酶切体系如下

注：酶切反应的时间及温度设置由具体限制性内切酶决定。

用PCR产物回收试剂盒纯化后，溶于ddH2O备用。

 

2）线性化载体制备

• 酶切体系如下

注：酶切反应的时间及温度由具体限制性内切酶决定。若为单酶切体系，反应结束后每50μL体系中补3μL quick CIP，37℃孵育30min，85℃ 30min热失活。

• 回收与纯化：1%核酸胶电泳检测酶切结果，并切下正确大小的载体片段进行胶回收。

 

3.连接和转化

将文库片段定向连接到质粒、纯化后电转化细菌，是将寡核苷酸片段变成 “可扩增、可保存、可用于后续筛选“的质粒文库的关键一步，该步骤决定了文库多样性、正确性和扩增效率。

1）文库组装

• T4连接

体系如下：

*载体与片段摩尔比一般建议增加至1:6-1:10。

反应条件：22℃孵育2h，16℃孵育过夜。

电转前用PCR产物回收试剂盒纯化，溶于ddH2O备用。并浓缩至产物浓度大于100ng/μL。

 

2）电转转化

• 提前打开电转仪，程序选择细菌列表中的Ec2，显示参数选择ms，按pulse键无体系电击一下，参数显示为6.0ms，表示电转仪状态正常，可进行后续电击实验。

• 取-80℃冰箱保存的电转感受态一支，于冰上化开，吸取小于5μL上述纯化体系加入中50μL感受态，体系置于冰上，依次进行电击实验。

• 转移质粒-感受态体系至提前预冷的电击杯中（避免气泡），擦干外侧的水分，置于电击室内，按pulse键，听到蜂鸣声后，迅速用1ml SOC培养基重悬电转体系并转移至干净的EP管中，于37℃震荡复性1h。

• 取10μL菌液用于梯度稀释，计算菌液库容。具体步骤为：取干净的LB液体培养基，90μL/孔分装（一般分装10管即可）至96孔深孔板中，并做好3、4、5····12等的标记；而后取复性后的菌液10μL加入编号为3的孔内，混匀后取10μL溶液中加入编号为4的孔内，而后依次进行十倍稀释。稀释后每孔取10μL菌液点滴于已添加载体相关的抗生素LB平板上，倒置于37℃培养箱过夜培养。次日计算库容。

• 菌液库容计算公式为：库容=克隆计数×10孔编号。一般要求文库库容大于50-100×序列多样性。

电转仪设置注意事项：在 BioRad Micropulser 电转仪上，建议选择 Ec2程序。该程序施加 1.8 kV 的脉冲。如果连接反应已从盐分中充分纯化且没有气泡，则时间常数应超过 4ms。时间常数低于该值表明溶液中盐浓度较高，会导致电转效率低下。

 

4.质控和质粒制备

1）单克隆Sanger测序

挑取库容计数平板上的单克隆菌落于已添加载体相关的抗生素液体LB培养基中，置于37℃培养箱振荡培养过夜后送sanger测序。

2）文库质粒抽提

从过夜培养的固体平板上刮下菌落，并取1ml文库菌液于200ml 液体A+ LB培养基中，置于37℃培养箱振荡培养16小时后抽提质粒，具体实验操作参考试剂盒说明书。

3）NGS测序

用制备片段的引物扩增文库质粒中的多样性序列区域，PCR体系如下：

• PCR反应混合液组分

• PCR反应程序

*退火温度需依据引物序列调整。

• PCR产物做2％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收大小正确的目的片段，用胶回收试剂盒纯化后，溶于ddH2O用于制备NGS测序样本。后续建库流程的具体实验操作参考试剂盒（QuarPrep EZ DNA Library Kit 1.0/#NL1002）说明书。

【参考文献】Uzonyi A, Nir R, Schwartz S. Cloning of DNA oligo pools for in vitro expression. STAR Protoc. 2022 Jan 17;3(1):101103. doi: 10.1016/j.xpro.2021.101103. PMID: 35462793; PMCID: PMC9019715.