实验Protocol｜高通量基因合成技术指南之——载体构建实验全流程

载体构建是基因功能研究的入门第一步，简单来说，就是将目的基因通过分子克隆技术插入合适的载体，形成一个能在宿主细胞内稳定存在并行使功能的重组DNA分子，想要目的基因发挥作用，这一步必不可少。

但实际操作中，很多科研人都经历过翻车事件，其实，90%的载体构建失败都不是操作能力问题，而是由于流程不标准、细节有疏漏、避坑要点不到位。今天，我们就以迪赢的基因片段产品为例教大家如何构建载体质粒，我们梳理了超超超详细的实验全流程，帮你从入门到精通，轻松拿下载体构建实验！

载体构建核心原理

 

一、实验前期设计准备

1.选择合适的克隆位点

载体线性化位点尽量选择无重复序列且片段插入位点上下游15-25 bp区域内GC含量均在40-60%的区域，并选择不兼容、无星号活性、目的基因内部无对应位点的限制性内切酶。

2.引物设计

1）T4连接引物设计原则

• 上游引物：5’端添加「保护碱基（2-3 个）+第一种酶切位点+目的基因上游序列」；

• 下游引物（Reverse）：5’端添加「保护碱基（2-3 个）+第二种酶切位点+ 目的基因下游反向互补序列」；

• 引物长度：20-25 bp，Tm值55-65℃，上下游Tm值差异≤2℃，避免发夹结构和二聚体。

2）同源重组引物设计原则

• 上游引物：5’端添加载体同源臂序列+第一种酶切位点+目的基因上游序列；

• 下游引物（Reverse）：5’端添加载体同源臂序列+第二种酶切位点+目的基因下游反向互补序列。

 

二、核心实验步骤

1.获取目的基因片段

• 高通量基因片段合成

高质量、低成本的基因片段是加速实验进展，确保后续研究有效推进的重要保障。传统方法单次只能处理少量DNA序列，而高通量技术利用微阵列芯片极大提升了通量与效率，可将耗时数周的工作压缩至数天并显著降低合成成本，解决了传统方法在产量、成本、质量、长度和复杂性上的瓶颈。

迪赢生物于高通量DNA芯片合成平台的核心技术迭代，面向科研与工业客户提供更强、更快、更省的高通量Mini-pool基因片段合成服务，单批次可同时合成144个片段，片段克隆子正确率接近80%媲美传统一代基因合成片段。

迪赢高通量合成平台

 

2.酶连

目的基因在重组酶作用下克隆到重组载体。

1）酶切载体

• 反应体系：2ug空载体，2ul位点酶，3ul反应buffer，补水到20ul；

• 反应程序：37℃1h反应。

2）载体回收：凝胶电泳后切割正确的载体片段，切胶回收得到酶切后的线性化载体。

3）重组连接反应

• 反应体系：50ng载体，100ng片段，重组酶10ul，补水至20ul。

• 反应程序：50℃ 1h。

注意事项：酶连反应中，重组酶的选择直接关系到实验效果，高效的重组酶不仅能够实现快速、高效的无缝克隆，还能简化操作流程，提升实验成功率，迪赢QuarCam无缝克隆试剂盒Plus(Ready Mix)可实现1-12个插入片段（长度50 bp-12 kb）的高效无缝拼接克隆，同时也提高了重组体系对杂质的耐受度，使得线性化载体与插入片段可以不纯化直接用于重组反应，极大的简化了实验步骤。

3.感受态细胞转化

• 取10ul连接产物加入到分装好的感受态细胞，冰浴15min后42℃热激1min，加入400ul液体培养基复苏1h。

• 涂布平板，挑单克隆培养摇菌。

注意事项：载体线性化不完全（原始质粒残留）或载体自连（单酶切获得线性化载体）是造成假阳性的一个常见因素，通过阴性对照的情况，可以快速排查假阳性是否由载体线性化不完全导致。

4.阳性克隆筛选与鉴定

• 菌落PCR：挑取平板上圆润、独立的单菌落，置于含10 μL无菌水的EP管中，吹打混匀，取2 μL作为PCR模板，使用目的基因特异性引物进行扩增，电泳检测出现目的条带的为疑似阳性克隆。

• 摇菌提质粒：将初筛阳性的菌落接种至含对应抗生素的LB液体培养基中，37℃、220 rpm振荡培养过夜，按照质粒小提试剂盒提取质粒。

• 双酶切验证：配制酶切体系对提取的质粒进行双酶切，电泳检测若出现线性化载体条带和目的基因条带，说明载体构建初步成功。

• 测序终验：将验证合格的质粒送测序，比对序列与目的基因序列完全一致、无突变、无移码突变，即为重组载体构建成功。

 

三、避坑要点

• 载体与片段摩尔比1:3~1:10；必须做载体自连阴性对照。

• 感受态细胞全程冰上操作，热激温度和时间严格把控，避免温度波动降低转化效率；感受态避免反复冻融。

• 测序验证必做，酶切验证仅能确认片段大小，无法排除碱基突变、移码突变，必须通过测序验证载体序列准确性。

后续步骤

载体构建完成后，可以进行：

• 扩增抽提：挑取正确的阳性克隆，扩大培养后提取大量重组质粒；

• 转染表达：将重组质粒转染细胞或转化表达菌，进行蛋白表达、功能验证等。