实验干货｜高通量基因合成技术指南②：搞定质粒扩增与抽提

实验人都懂的痛——再简单的常规实验，也躲不开翻车现场，一旦失手，之前的努力直接白费！上期我们结合迪赢一线实战经验，完整梳理了载体构建全流程+避坑攻略（从入门到精通，高通量基因合成技术指南之——载体构建实验全流程）。本期干货继续，一起来攻克质粒扩增抽提！

不管是基因克隆、载体构建，还是细胞转染、蛋白表达，都离不了高纯度、高产量的质粒DNA。其实，质粒扩增抽提并不复杂，只要吃透每一步原理、抓牢关键细节，搭配实用避坑指南，就能稳稳做出理想数据～

一、主要实验流程

二、核心实验步骤

质粒扩增

1）取出甘油菌，用灭菌枪头刮取少量菌液，划线接种于含相应抗生素的LB固体平板上，37℃倒置培养12-16小时（过夜培养），待其长出圆润、独立单菌落。

2）挑取平板上形态饱满、大小适中的单菌落，接入3–5mL抗性LB液体培养基，37℃、250rpm 振荡活化8–12小时。

注意：抗生素浓度需按质粒抗性设置。

3）大规模扩增：按1:50~1:100比例，转接活化菌液至大体积LB液体培养基， 37℃、250 rpm 振荡培养 12~16小时。

注意：高拷贝质粒12h即可收获，低拷贝可适当延长至16 h提升产量，不要过度培养，过久可能导致菌体老化、杂菌滋生，大幅降低质粒纯度。

4）菌体收集：分装菌液至离心管， 取1~5mL过夜菌液（高拷贝1-2mL，低拷贝5mL）加入无菌EP管；12000rpm 离心1min，弃上清。

注意：若菌量不足，可多次离心富集菌体，务必彻底弃除上清，残留培养基可能导致裂解不充分。

质粒提取

质粒提取一般采用碱裂解法，其目的是去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA 分开，随后去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。

1）重悬：加入预冷溶液I（使用前需加入RNase A），充分吹打混匀，无明显菌体团块。

注意：必须彻底重悬，结块会导致裂解不完全，产量减半.

2）裂解：加入新鲜溶液II，轻柔颠倒混匀6~8次，室温放置3~5min。

注意：不要剧烈震荡，防止基因组DNA断裂，造成严重基因组污染；裂解时间不超过5分钟，长时间碱性环境可能导致质粒不可逆变性）

3）中和沉淀：加入0.7倍体积预冷溶液III，轻柔颠倒混匀4~6次，出现白色絮状沉淀；室温12000rpm离心10min，小心吸取上清至吸附柱中（切勿吸到白色沉淀）；12000rpm 离心1min，弃废液，质粒结合在柱膜上。

4）纯化沉淀：取上清加等体积苯酚:氯仿抽提（去蛋白），加2倍无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤后干燥，ddH2O溶解。

质粒质量检测

抽提完成后须检测质粒浓度和质量，质粒合格方可用于下游实验。

1）纯度检测：OD260/280比值在1.8~2.0为理想纯度；低于1.8提示蛋白质或酚类污染，高于2.0提示核酸降解、RNA污染。

2）电泳验证：使用1%琼脂糖凝胶，上样量2µl，纯质粒出现清晰的超螺旋条带，无弥散拖尾、无基因组杂带，如有拖尾或弥散条带，说明存在降解或污染。

迪赢扩增提取的质粒电泳验证图

3.保存方法：短期4℃保存，长期分装-20℃/-80℃冻存，避免反复冻融，防止质粒降解断裂。

三、常见问题及避坑要点

1）质粒产量低

通常由于菌种状态差或细菌密度过低 ➡ 优先挑选圆润饱满的新鲜单菌落，严格匹配抗生素抗性；调整培养时间至12—16小时，避免过度生长。

2）质粒纯度不足

• RNA污染 ➡ 实验前确认RNase A活性，按需新鲜添加，如加完后储存过久需补加；

• 蛋白质污染 ➡ 确保蛋白质去除到位，如70%乙醇务必洗涤两次，彻底脱盐；柱纯化必须完成2次漂洗，杜绝盐分、蛋白残留。

3）基因组污染：裂解时剧烈操作或碱性作用时间过长，会导致染色体DNA断裂并复性进入上清，需控制颠倒次数（6-8次）和静置时间（≤5分钟）。

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