使用寡核苷酸池构建人类全基因组的 sgRNA 文库

 

文库构建

 

构建定制的 CRISPR sgRNA 文库，其中包含 65383 个针对人类全基因组的 sgRNA。所有 sgRNA 在高通量 DNA 合成平台上同时合成，然后将合成的寡核苷酸扩增并克隆到慢病毒载体中。

图1. sgRNA文库构建流程

 

 

文库错误率低

 

选取一个批次构建完成后随机抽取30个克隆进行桑格测序。测序结果表明在随机挑选的克隆中，100%的sgRNA序列和理论序列完全一致。

 

图1. 桑格测序结果

 

 

覆盖率高、分布均一，批次间稳定性高

 

文库的覆盖度和分布均一性是评价文库质量的重要指标，使用NGS方法进行验证。覆盖率是指构建文库中包含目标序列的比例。理想状态下文库中不同sgRNA是均匀分布的，但因PCR过程及克隆过程会有一定的偏好性，导致一部分sgRNA reads数较低，一部分sgRNA reads数较高，因此使用均一性评价文库中序列分布的均匀程度，通常采用分布斜率Skew Ration评价，通常认为数值<10代表为合格文库，数值越小代表均一性越好。

 

 

四个批次构建文库数据分析结果如下：

 

Batch number	Diversity of designed library	Actual diversity of the library	Coverage	skew ratio
01	63950	63950	100%	2.24
02	63950	63940	99.98%	2.39
03	63950	63937	99.98%	2.91
04	63950	63943	99.99%	2.29